1969年2月，屠呦呦接受了中草药抗疟研究的艰巨任务。她首先从收集整理历代医籍、本草、地方药志的单、验方入手，还走访当时中医研究院内老中医专家，搜集建院以来的有关群众来信，整理了一个从2000余方药中选编的以640种药物为主的抗疟方药集，并且在此基础上，进行实验研究，组织鼠疟筛选。然而，筛选的大量样品，均无好的苗头。不久，屠呦呦服从组织安排，到海南岛疟区实验室工作半年之久，回北京后，由于种种原因工作难以开展。1971年，抗疟队伍再次在广州召开专业会议，周恩来总理对此作了重要指示。屠呦呦也参加了这次会议，并肩负新的任务回到北京，组织力量成立课题组，投入了新的攻关研究。
这次，在重新考虑对一些基础比较好的药物进行复筛时，她又系统查阅有关文献，特别注意在历代用药经验中吸取药物合理提取方法的线索，以寻找突破口，东晋名医葛洪《肘后备急方》中称，有“青蒿一握，水一升渍，绞取汁服”可治“久疟”。她细细琢磨这段记载，觉得里面大有文章。屠呦呦根据这条线索，改进了提取方法，采用乙醇冷浸法将温度控制在60℃，所得青蒿提取物对鼠疟效价有了显著提高; 接着，用低沸点溶剂提取，使鼠疟效价更高，而且趋于稳定。
当时正是“文化大革命”的非常时期，政治冲击一切。在这样的环境下，屠呦呦等人仍不受任何干扰，日以继夜地埋头于实验室，反复进行抗疟实验研究，终于在1971年10月4日，即广州会议后的第191次实验(先后筛选方药200余种)中，获得了青蒿抗疟发掘的成功。青蒿提取物对鼠疟原虫抑制率达100%，她又把青蒿提取物分为中性和酸性两大部分，并发现中性部分抗疟效价高而毒副作用低，酸性部分无效而毒性大。在确证中性部分为青蒿抗疟有效部分后，又进行猴疟实验，取得同样满意的效果。
此后，她又进行了深入的药理、毒理研究，为确保用药安全她还亲自试服。在这种情况下，屠呦呦于1972年8-10 月，偕同有关医务人员携药赴海南昌江地区试用，从间日疟到恶性疟，从本地人口到外地人口，首次取得30例青蒿抗疟的成功。1973年，又在同一地方首次试用青蒿素单体，肯定其抗疟疗效胜于优选抗疟药氯喹。接着在全国各地的大力协助下，进一步扩大临床验证，至1978年，共治疗2099例(其中包括间日疟1511例，恶性疟588例)，全部获得临床痊愈，使青蒿素真正成为一种令人瞩目的新结构类型抗疟新药。
在临床证实青蒿抗疟有效的基础上，屠呦呦等人发扬连续作战的精神，从中性部分进一步分离提纯青蒿有效单体。这种新型化合物被命名为“青蒿素”，经大量化学工作、衍生物制备结合四大光谱研究，确定为倍半萜类成分。由于其结构的特殊性，后又在中国科学院生物物理研究所和有机化学研究所等单位的支持协助下，用X-衍射方法最终确定了其化学结构。青蒿素为一具过氧基团的“倍半萜内酯”，该结构仅含有碳、氢、氧3种元素，从而突破了抗疟药必须具有含氮杂环的理论“禁区”。结果还揭示，青蒿素的抗疟活性与“倍半萜内酯”结构中的过氧基团相关，为结构改造工作打下了理论基础。
1977年3月，首次以“青蒿素结构研究协作组”名义撰写的论文《一种新型的倍半萜内酯——青蒿素》发表于《科学通报》(1977年第3期)，引起了世界各国的密切关注和高度重视。 | 
